馬鈴薯(shu)莖(jing)尖超(chao)低溫冷凍(dong)脫(tuo)(tuo)毒(du)方法一般按(an)照選擇(ze)材(cai)料、切取(qu)莖(jing)尖、預培(pei)養、預處理、超(chao)低溫冷凍(dong)、解凍(dong)、恢復培(pei)養、脫(tuo)(tuo)毒(du)效果檢測、組(zu)織培(pei)養擴繁(fan)這幾個步驟來獲(huo)得再生植株，經過病毒(du)檢測后，無(wu)毒(du)植株用于生產脫(tuo)(tuo)毒(du)馬鈴薯(shu)種薯(shu)（圖2）。

1. 選擇材料

馬(ma)鈴(ling)薯(shu)不同(tong)部位的(de)組(zu)(zu)織(zhi)經(jing)過超低溫(wen)冷凍處理后細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)存活力有明顯差異。一(yi)般細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)體積小細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)質(zhi)較濃、液(ye)泡少的(de)分生組(zu)(zu)織(zhi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)會比液(ye)泡大的(de)成(cheng)(cheng)熟的(de)分化細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)再(zai)生能力強、成(cheng)(cheng)苗率也高。研究發現(xian)選擇馬(ma)鈴(ling)薯(shu)莖(jing)尖分生組(zu)(zu)織(zhi)作為處理對象，可以提高成(cheng)(cheng)苗率，有利(li)于獲得(de)脫毒苗。

2. 預培養材料

材料(liao)通(tong)過(guo)預(yu)培(pei)(pei)養(yang)使得(de)細(xi)(xi)胞(bao)適度(du)(du)脫水(shui)，減少細(xi)(xi)胞(bao)內自(zi)由水(shui)含量，可(ke)(ke)以提高細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)抗冷(leng)凍能(neng)力，從而提高成(cheng)活率。目(mu)前常用(yong)(yong)的(de)(de)(de)預(yu)培(pei)(pei)養(yang)方式是在培(pei)(pei)養(yang)基(ji)(ji)中(zhong)添加一(yi)些使細(xi)(xi)胞(bao)脫水(shui)的(de)(de)(de)保護性物質(zhi)，可(ke)(ke)以選用(yong)(yong)蔗糖、二(er)甲基(ji)(ji)亞砜、甘露(lu)醇(chun)等。在高濃度(du)(du)保護性物質(zhi)處理之前選用(yong)(yong)0~5℃的(de)(de)(de)低溫馴化，可(ke)(ke)以明顯(xian)提高成(cheng)活率。馬(ma)鈴薯莖尖可(ke)(ke)以切取(qu)2~3mm大小，然后放在0.3mol·L-1高蔗糖濃度(du)(du)的(de)(de)(de)預(yu)培(pei)(pei)養(yang)基(ji)(ji)中(zhong)預(yu)培(pei)(pei)養(yang)一(yi)天，光(guang)照16h，光(guang)照強度(du)(du)2000lx。高濃度(du)(du)的(de)(de)(de)蔗糖可(ke)(ke)增加培(pei)(pei)養(yang)基(ji)(ji)的(de)(de)(de)滲透壓，使得(de)馬(ma)鈴薯莖尖組(zu)織的(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)脫水(shui)，從而減少細(xi)(xi)胞(bao)內自(zi)由水(shui)的(de)(de)(de)含量。

3. 保護劑處理

常(chang)(chang)用的(de)抗(kang)冷(leng)凍保護(hu)劑是能夠(gou)穿透(tou)細(xi)胞膜(mo)(mo)的(de)化(hua)合物DMSO和各種糖(tang)類物質，通過(guo)促(cu)進細(xi)胞膜(mo)(mo)對水分的(de)通透(tou)性(xing)，降低(di)細(xi)胞內(nei)水分冰點溫度，避免胞內(nei)外冰晶形成(cheng)，保護(hu)細(xi)胞內(nei)的(de)核酸、蛋白(bai)質等(deng)生物大分子物質。保護(hu)劑的(de)選擇是超(chao)低(di)溫處(chu)理成(cheng)功(gong)的(de)關鍵因(yin)素，好的(de)保護(hu)劑應該滿足對細(xi)胞毒性(xing)小、易溶于(yu)水、解凍后容易從細(xi)胞中清洗掉等(deng)要求。目前常(chang)(chang)用Sakai于(yu)1990年創立的(de)按照一定配方合成(cheng)的(de)多種保護(hu)劑復合液，被稱為植物材(cai)料玻(bo)璃(li)化(hua)溶液（plant vitrification solution，PVS）。將(jiang)預培養一天后的(de)馬鈴薯莖尖加載到(dao)PVS2溶液中，其(qi)中PVS2液的(de)成(cheng)分為：MS+30%（W/V）甘油+15%（W/V）乙二(er)(er)醇+15%（W/V）二(er)(er)甲基(ji)亞砜（DMSO）+0.4mol·L-1蔗糖(tang)。具(ju)體方法是用移液管吸取15μL的(de)PVS2溶液加在0.03mm厚的(de)1.0cm×4.0cm的(de)鋁箔上，然后將(jiang)預培養后的(de)馬鈴薯莖尖裝載到(dao)PVS2液滴中，室(shi)溫25℃下處(chu)理20min，成(cheng)活率可達90%。

4.液氮冷凍處理

將(jiang)(jiang)包裹有馬鈴薯莖尖(jian)的鋁箔(bo)(bo)在液氮(dan)中蘸一下，然(ran)后把鋁箔(bo)(bo)條放入1.5mL離心管(guan)中，再將(jiang)(jiang)離心管(guan)置于液氮(dan)中超(chao)低(di)溫(wen)處理1h。

5. 解凍洗滌

對超(chao)(chao)低溫(wen)處(chu)理(li)后的(de)(de)(de)材料需要馬(ma)上進(jin)行解凍(dong)(dong)，常(chang)用(yong)(yong)的(de)(de)(de)解凍(dong)(dong)方法(fa)有(you)兩種：一(yi)是快速(su)解凍(dong)(dong)法(fa)，適(shi)合(he)于(yu)大多數材料，具體做法(fa)是將(jiang)液(ye)氮中(zhong)(zhong)冷凍(dong)(dong)1小時后的(de)(de)(de)材料放于(yu)25~40℃的(de)(de)(de)水浴鍋中(zhong)(zhong)進(jin)行解凍(dong)(dong)1~3min*融化后取(qu)出材料，避(bi)免(mian)水浴溫(wen)度(du)對細(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)熱傷(shang)害以(yi)及保(bao)護劑對細(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)毒害作用(yong)(yong)。另一(yi)種是慢速(su)解凍(dong)(dong)法(fa)，適(shi)用(yong)(yong)于(yu)經過低溫(wen)馴化或(huo)者(zhe)經過脫(tuo)水處(chu)理(li)的(de)(de)(de)材料，把液(ye)氮處(chu)理(li)1h后的(de)(de)(de)材料在0℃下慢速(su)解凍(dong)(dong)30min左右。解凍(dong)(dong)后的(de)(de)(de)材料一(yi)般都(dou)需要立刻洗(xi)(xi)滌，為(wei)了除去細(xi)胞(bao)內含的(de)(de)(de)高濃(nong)度(du)保(bao)護劑，避(bi)免(mian)對恢復培(pei)(pei)養的(de)(de)(de)影響。常(chang)用(yong)(yong)的(de)(de)(de)洗(xi)(xi)滌方法(fa)是室溫(wen)下用(yong)(yong)含1~2mol·L-1蔗糖濃(nong)度(du)的(de)(de)(de)培(pei)(pei)養基洗(xi)(xi)滌10min左右。在無菌超(chao)(chao)凈工作臺(tai)中(zhong)(zhong)，將(jiang)液(ye)氮處(chu)理(li)1h后的(de)(de)(de)包裹馬(ma)鈴薯莖尖鋁箔條從離心管中(zhong)(zhong)取(qu)出，然后迅速(su)放入加有(you)1.2mol·L-1蔗糖濃(nong)度(du)的(de)(de)(de)液(ye)體MS培(pei)(pei)養基中(zhong)(zhong)洗(xi)(xi)滌2~3次(ci)，每次(ci)10min。

6. 恢復培養

經過(guo)洗(xi)滌后的(de)材料需要立即(ji)轉(zhuan)移到恢復培養基上(shang)進(jin)行培養。研究(jiu)發(fa)現將材料先(xian)培養在(zai)(zai)黑暗或弱光(guang)下一段時間(jian)后，再在(zai)(zai)正(zheng)常光(guang)照下有利于形成再生植(zhi)株。

將(jiang)洗滌(di)(di)后(hou)(hou)的(de)馬鈴薯莖尖在無菌(jun)超凈工作臺中取出，用(yong)無菌(jun)紙吸(xi)去殘留在材料表面的(de)洗滌(di)(di)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基，接(jie)種(zhong)到固(gu)體恢復培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基（MS＋0.1mg·L-1NAA＋0.5mg·L-16-BA＋1.0mg·L-1GA3）上(shang)進行培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)。培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)條件選擇先黑暗培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)7d，再在弱(ruo)光1000lx下培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)7d，然后(hou)(hou)正常光照2000lx培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)。當分化出根(gen)芽后(hou)(hou)轉移到MS培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)基上(shang)，1個(ge)月(yue)就可獲(huo)得完(wan)整植株，統(tong)計成活率。

7. 病毒檢測

對再生馬鈴薯(shu)(shu)試管苗用酶聯(lian)免疫法進行(xing)(xing)病(bing)毒檢測，只有不帶病(bing)毒的組(zu)培苗才可以進行(xing)(xing)組(zu)織培養(yang)擴繁(fan)，用于生產無(wu)毒馬鈴薯(shu)(shu)種薯(shu)(shu)。